高效液相色谱基础知识- - - - - -
原则和参数

液相色谱法是一种非常成熟的物质分离技术。高效液相色谱(HPLC)是一种适用于分析的方法，有着广泛的应用领域。在这里，我们描述了HPLC的原理，介绍了HPLC系统中最重要的成分和决定测量成功的因素。

高效液相色谱法原理

高效液相色谱(HPLC)的分离原理是基于分析物(样品)在流动相(洗脱液)和固定相(柱的包装材料)之间的分布。根据分析物的化学结构，分子在通过固定相时被延缓。样品分子与包装材料之间特定的分子间相互作用决定了它们在“柱上”的时间。因此，不同成分的样品洗脱在不同的时间。从而实现了样品成分的分离。
检测单元(如紫外检测器)在离开色谱柱后识别分析物。信号由数据管理系统(计算机软件)转换和记录，然后显示在色谱图中。通过检测器单元后，可对流动相进行附加检测器单元、部分收集单元或对废物进行收集。一般而言，HPLC系统包含以下模块:溶剂库、泵、进样阀、柱、检测器单元和数据处理单元(图1)。溶剂(洗脱液)由泵以高压和恒速通过系统。为了使检测器信号的漂移和噪声尽可能低，泵的恒定无脉冲流量是至关重要的。分析物(样品)通过进样阀提供给洗脱液。

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梯度和权力平等主义的

根据流动相的组成，一般适用两种不同的模式。如果流动相的组成在分离过程中保持不变，则HPLC系统定义为等稳洗脱系统。当分离过程中流动相的组成发生变化时，HPLC系统被定义为梯度洗脱系统。使用梯度系统，有两种不同的技术:低压梯度(LPG)和高压梯度(HPG)。低压梯度意味着溶剂的混合在泵的上游(吸入侧)进行。在高压梯度系统中，不同的溶剂由单独的泵提供，并在泵后混合(排出侧)。图2显示了LPG和HPG梯度模式的典型系统配置。

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列

该柱代表任何HPLC系统的核心。它负责样品成分的充分分离。分离效率与柱内径、柱长、柱填料类型和粒径有关。根据需要的应用，许多高效液相色谱柱是商业上可用的。不同的包装材料支持不同的分离机制——常见的是用于正相、反相、尺寸排斥、离子交换、亲和、手性或亲水作用的高效液相色谱材料。在图3中显示了分析柱和制备柱。

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探测器

检测器单元的任务是记录从柱中洗脱的物质的时间和量。检测器感知洗脱液成分的变化，并将该信息转换为电信号，该电信号在计算机的辅助下进行评估。根据被分析物的结构特征，可以使用多种检测器。常用的探测器单元是折射、紫外/可见、电化学和荧光探测器。图4显示了具有不同探测器的两种等稳系统配置。

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色谱参数

被流动相运输的分离分析物被检测器单元记录为信号峰。所有峰的总数称为色谱图。每个单独的峰提供分析物的定性和定量信息。定性信息由峰本身给出(例如:形状、信号的强度、在色谱图中出现的时间)。此外，峰的面积与物质的浓度成正比。因此，色谱数据管理软件可以通过积分计算出样品的浓度。这提供了定量信息。理想情况下，峰值记录为高斯钟形曲线。图5给出了一个示意图示例。下面讨论色谱分离的基本参数。

延迟时间(t0)
延迟时间指的是非延迟化合物从注射部位运输到检测器(记录该化合物的检测器)所需的时间。在此期间，所有样品分子都只位于流动相。一般来说，所有样品分子具有相同的延迟时间。分离是由于物质与固定相的粘附程度不同而引起的。

保留时间(tR)
保留时间是指化合物从注射时刻到检测时刻所需的时间。因此，表示被分析物处于流动相和固定相的时间。保留时间是特定于物质的，在相同的条件下应该始终提供相同的值。

峰宽(w)
峰值宽度涵盖了从信号斜率的开始到探测器信号重复下降后达到基线的周期。

拖尾因子(T)

实际上，完美对称的山峰非常罕见。在色谱图中，它们经常显示出一定程度的尾屑。峰值尾迹由尾迹因子t来测量，该因子描述了峰值的不对称性，即形状在多大程度上近似于完美对称的高斯曲线。计算尾迹系数为:T=b/a a为峰前半段宽度，b为峰后半段宽度。从峰的前缘或后缘到从峰的顶点垂直下降的一条线，在峰高度的10%处测量值(见图5)。[4]T = 1表示一个对称的峰。对于T > 1，其峰值剖面图称为tail。对于T < 1的峰形称为前峰。